液相色譜（High Performance Liquid Chromatography）是近年來發(fā)展起來的一種具有高靈敏度、高選擇性的快速分離分析技術(shù)。它既能用于微量組分的分析測(cè)定，又能用于大量的制備分離，靈活多樣。液相色譜在使用過程中常會(huì)出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問題，如果了解一些日常使用和維護(hù)注意事項(xiàng)，就能做到早預(yù)防、勤維護(hù)，使分析結(jié)果保持較好的穩(wěn)定性與較高的性。
一、流動(dòng)相
1.流動(dòng)相的性質(zhì)要求
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下特點(diǎn)：
1.1流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的性質(zhì)。
1.2純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累，影響色譜柱的使用壽命。流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0.45um或更細(xì)的膜過濾）。
1.3流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。比如使用紫外檢測(cè)器時(shí)，所用的流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收或吸收很小，溶劑中如果有吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)使檢測(cè)背景提高，靈敏度降低，且用作梯度洗脫時(shí)會(huì)引起嚴(yán)重漂移。。
1.4對(duì)樣品的溶解度要適宜。流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。
1.5流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
2.流動(dòng)相的PH值
流動(dòng)相的pH 值應(yīng)控制在2～8 之間。當(dāng)pH 值大于8 時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH 值小于2 時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。
3.流動(dòng)相的脫氣
HPLC所用的流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測(cè)。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相反應(yīng)，一般采用超聲脫氣。
4.流動(dòng)相的過濾
所用溶劑使用前必須經(jīng)0.45um濾膜濾過，以除去雜質(zhì)微粒。用濾膜過濾時(shí)，注意分清有機(jī)相和水相濾膜。且勿混用，有機(jī)相濾膜過水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜過有機(jī)溶劑時(shí)，濾膜會(huì)被溶解。嚴(yán)禁溶有濾膜的溶劑用于液相色譜分析中。
5.流動(dòng)相的貯存
流動(dòng)相一般貯存于玻璃或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存于塑料容器內(nèi)。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器內(nèi)一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化。也防氧和二氧化碳溶入溶劑。應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。
6.實(shí)驗(yàn)用水
實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)為超純水，并通過濾膜過濾。
二、色譜柱
液相色譜法對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。所以說色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況。因此在安裝時(shí)要輕拿輕放。
2.色譜柱的使用方向 色譜柱所示方向是評(píng)價(jià)流動(dòng)相流動(dòng)方向。不可以反沖會(huì)迅速降低柱效。
3.色譜柱PH使用范圍是2.0-9.0。當(dāng)使用PH值范圍邊界時(shí)，分析結(jié)束立即用與所使用流動(dòng)相互溶的溶劑*清洗置換流動(dòng)相。
4.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其生物樣品直接注入柱內(nèi)，是用預(yù)處理柱。
5.每次分析結(jié)束后，都要對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗。每次工作完后，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗。
6.若長(zhǎng)時(shí)間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲醇或乙腈封存。
三、泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，應(yīng)按以下注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：
1.防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)等，泵的入口應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。
2.流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)。尤其是在停泵過長(zhǎng)時(shí)間情況下。由于溶液靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體。同樣會(huì)損壞密封環(huán)、柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗。再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑。
3.要防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相用完，空泵運(yùn)轉(zhuǎn)會(huì)磨損柱塞或密封環(huán)，zui終產(chǎn)生漏液。
4.壓力不要超過規(guī)定的zui高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形漏液。
5.流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量的氣泡，泵就無法正常工作。
四、檢測(cè)器的維護(hù)
作為液相色譜儀的三大關(guān)鍵部件（輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器）之一的檢測(cè)器，主要用于監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，將樣品組成和含量變化轉(zhuǎn)化為可供檢測(cè)的信號(hào)，完成定性、定量分析。常用的檢測(cè)器主要有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等。
1.紫外檢測(cè)器
使用紫外檢測(cè)器時(shí)要注意環(huán)境因素帶來的干擾由于靜電的作用，檢測(cè)器在使用時(shí)易于從周圍環(huán)境中吸附塵埃，覆蓋在光學(xué)元件上的塵埃能降低光的傳播效率，加大了光的散射，對(duì)檢測(cè)有影響。故紫外檢測(cè)器周圍的環(huán)境要清潔，經(jīng)常打掃，保持干凈。強(qiáng)紫外照射還會(huì)使一些光學(xué)材料涂層降解，慢慢增加噪聲，故檢測(cè)器應(yīng)避免陽光直射。長(zhǎng)時(shí)間不用檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)定期沖洗流路趕走池內(nèi)產(chǎn)生的氣泡。
2.熒光檢測(cè)器的使用與維護(hù)
熒光檢測(cè)器的靈敏度比紫外檢測(cè)器高，特別適用于痕量組分檢測(cè)。日常使用中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
2.1不能使用抑制或吸收熒光的溶劑作流動(dòng)相仁。
2.2溶劑的極性和溶液的溫度對(duì)熒光強(qiáng)度有明顯的影響。增大溶劑的極性，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。通常熒光物質(zhì)溶液的熒光效率和熒光強(qiáng)度，隨著溫度的升高而降低，液相色譜中，熒光檢測(cè)器通常在室溫下操作，可以保證足夠的靈敏度。
2.3當(dāng)樣品濃度過高時(shí)，熒光物質(zhì)分子易與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起溶液的熒光強(qiáng)度降低，熒光強(qiáng)度不再與濃度呈線性關(guān)系，即熒光淬滅效應(yīng)。因此，在進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，試樣要配成低于10-6g/mL濃度的溶液，要使用不含熒光物質(zhì)的溶劑。
液相色譜儀正以它分辨率高、分析速度快和應(yīng)用廣泛的優(yōu)點(diǎn)倍受儀器分析工作者的青睞，廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品檢測(cè)等領(lǐng)域。我們?cè)诠ぷ髦校瑸楸ＷC分析結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，必須重視和加強(qiáng)對(duì)液相色譜儀的管理和維護(hù)。只有良好規(guī)范的管理，才能使儀器處于*工作狀態(tài)，保證各項(xiàng)分析工作順利完成，得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
